产品内容

HiFiLong DNA polymerase                2.5U/ul

10×HiFi Buffer                                 

50mM MgCl2                                   

特性

高保真性

HiFiLong DNA polymerase具有卓越的3'-5'核酸外切酶活性，因此其在DNA聚合过程中显示出超强的DNA校正功能，是目前保真性最高的DNA聚合酶。其保真性是Taq DNA聚合酶的80倍， Pfu DNA聚合酶的8倍以上。

高耐热性

HiFiLong DNA polymerase具有超强的耐热特性，酶活性半衰期在95℃及100℃分别能达到12小时及3小时以上，因此在实际运用时可适当调高热变性步骤的温度，对于GC含量高的样本显示出卓越的DNA聚合功能。

高速度

延伸速度10s/kb，延伸10kb基因组只需1min40s。

长片段扩增

HiFiLong DNA polymerase能对6~12kb基因组进行长片段扩增，延伸时间标准为10s/kb，无需阶段性设置温度，可满足大多数PCR需要，具体应用中可以10s为基础延长扩增时间，以保证扩增效率。

用途

HiFiLong DNA polymerase的高保真性和高耐热性使其能将DNA通过PCR忠实扩增，特别适用于对保真性要求高的长片段DNA扩增，如基因精确克隆、定点突变等。

应用指导

使用方法（用户需自备：dNTP Mix、 dd H20、DNA模板、引物）

使用前请先将试剂混匀并离心，再配制反应体系。酶制品含有50%甘油，使用时需慢慢吸取。

50ul反应体系的配制：

10×HiFi Buffer                                     5ul

MgCl₂(50mM)                                   1.5ul

dNTP Mix (10mM each)                       2ul

模板                                                1-100ng（质粒）

                                                        100-1000ng（基因组）

正向引物(10uM)                               0.5~2.5ul

反向引物(10uM)                               0.5~2.5ul

HiFiLong DNA polymerase                    2.5U

ddH₂O补充至总反应体积50ul。

反应条件：

一般长片段DNA扩增时，建议反应条件：

98℃                                                         2min

98℃                                                         20sec.

55~60℃                                                   30sec

72℃                                                        10s/kb

30~35循环

当引物Tm值>68℃时，可以选择简化反应条件

98℃                                                         2min

98℃                                                         20sec.

68~74℃                                                   10s/kb                 

30~35循环

最后

72℃                                                         7min

注意

扩增基因组长片段时，建议引物长度为30~35bp,引物Tm值达到63℃以上；热变性温度建议在98℃至少2min以保证模板充分变性。

克隆策略

HiFiLongDNA polymerase产物属平滑末端，无3’端突出，不可直接用于TA克隆，建议按下述策略实施克隆：

1.          可运用InFusion方法将PCR产物直接链接到终载体上。

2.          运用引物将克隆酶切位点导入PCR产物后实施酶切后克隆。

3.          运用平端载体实施克隆，使用的引物5’端磷酸化碱基可直接克隆于平滑末端的载体；如果使用的引物5’端没有特别进行磷酸修饰，可将PCR产物磷酸化处理后直接克隆于平滑末端的载体。

4.          将PCR产物进行加A反应，直接应用TA克隆。在PCR反应结束后，每个反应体系中加入5U Taq酶，70-75℃培育15-30分钟即可。

活性定义

75℃，30min, 摄入10nmol的全核苷酸使其成为酸性不溶物的活性为1U。

保存 -20℃恒温保存1年

运输 2-8℃