产品内容

HiFi DNA polymerase                                  2.5U/ul

Reverse Transcriptase                               200U/ul

2×One-Step Hi-Fi RT-PCR buffer

ddH2O

特性

One-Step Hi-Fi RT-PCR  Kit将 First cDNA合成和高保真PCR过程在设置在同一反应体系中完成，用户只需要一次将逆转录酶、高保真DNA聚合酶、RNA模板及相应引物加到预混的反应缓冲液里，RT-PCR即可方便、快捷、有效地完成。

其中First cDNA由Reverse transcriptase合成，通过分子操作手段增加了该酶的热稳定性及逆转录效率，能高效迅速地将5kb以下的RNA模板转化成cDNA。PCR过程由HiFi DNA polymerase完成。由于HiFiDNA polymerase具备高保真性及高耐热性，通过Biovisualab的One-Step Hi-Fi RT-PCR buffer可以快速、高效获得保真性高的特异PCR产物。

1. 高效率cDNA合成。

2. 快速、高效、高保真扩增cDNA。

3. RT-PCR在同一反应管、同一反应体系内完成，方便快捷。

用途

方便、快捷、高效、高保真RT-PCR的首选。

应用指导

使用前请先将试剂混匀并离心，再配制反应体系。酶制品含有50%甘油，使用时需慢慢吸取。

使用方法

反应体系

2×One-Step Hi-Fi RT-PCR buffer               25 ul

模板                                                      10pg-500ng（viral/total RNA）

正向引物(10uM)                                    1~2.5ul

反向引物(10uM)                                    1~2.5ul

HiFi DNA polymerase                                 2.5U

Reverse Transcriptase                                 200U

ddH2O补充至总反应体积50ul。

 反应条件

42℃或50℃ 30min

反应条件：

95℃                                       2min

94℃                                       20sec.

55-65℃                                  30sec.

72℃                                       1kb/min

建议35~40循环

当产物小于1kb时，延伸时间调整为30sec即可。

注意

由于复杂结构的RNA可能对逆转录过程产生影响，对于复杂结构的RNA模板，建议将RNA样本先进行热变性处理（65℃，5min处理后立即冰浴），然后再进逆转录反应。

克隆策略

HiFi DNA polymerase产物属平滑末端，无3’端突出，不可直接用于TA克隆，建议按下述策略实施克隆：

1.          可运用InFusion方法将PCR产物链接到终载体上。

2.          运用引物将克隆酶切位点导入PCR产物后实施酶切后克隆。

3.          运用平端载体实施克隆，使用的引物5’端磷酸化碱基可直接克隆于平滑末端的载体；如果使用的引物5’端没有特别进行磷酸修饰，可将PCR产物磷酸化处理后直接克隆于平滑末端的载体。

4.          将PCR产物进行加A反应，直接应用TA克隆。在PCR反应结束后，每个反应体系中加入5U Taq酶（Cat. Z011-1000），70-75℃培育15-30分钟即可。

保存

-20℃

运输

2-8℃