应用建议

使用前请先将试剂混匀并离心，再配制反应体系。

50ul反应体系的建议配制方法

2×GREAT Real-Time Probe RT-PCR Buffer         25 ul

正向引物(10uM)                                       1.5ul(300nM)

反向引物(10uM)                                       1.5ul(300nM)

探针(2.5uM)                                              5ul (250nM)

根据需要使用ROX Reference Dye (50×) 1ul

模板                                                         10pg-500ng（viral/total RNA）

ddH2O补充至总反应体积50ul。

20ul反应体系的建议配制方法

2×GREAT Real-Time Probe RT-PCR Buffer         10 ul

正向引物(10uM)                                          0.6ul(300nM)

反向引物(10uM)                                          0.6ul(300nM)

探针(2.5uM)                                                 2ul (250nM)

根据需要使用ROX Reference Dye (50×) 0.4ul

模板                                                         10pg-500ng（viral/total RNA）

ddH2O补充至总反应体积20ul。

反应条件

42℃                 10~30min

94℃                                       1min

94℃                                       5sec.

60℃(56-64℃)                        30~60sec.

建议40循环。

保存

-20℃。 

运输

2-8℃

操作注意

1. 当同时需要进行多个Real-Time RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (2×GREAT Real-Time Probe RT-PCR Buffer，引物，ROX等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。

2. 使用2×GREAT Real-Time Probe RT-PCR Buffer时，应轻轻混匀，避免起泡；2×GREAT Real-Time Probe RT-PCR Buffer 融解后如有不溶物请充分混合。配制反应液时应避免强光照射。

3. 反应液的配制、分装请一定使用新的 (无污染的) 枪头、Microtube等，尽量避免污染。

4. 如需要配制标准品进行标准曲线方法对样品进行定量时，建议配制方法如下：

RNA核酸标准品提取后，测定OD值定量，将ug/ul换算为copies/ul。

简易换算公式：copies = 2X ug RNA/ RNA size × 1.8 × 10¹⁵

计算每个PCR反应管内标准品的上样体积和相应的copies。稀释前，将标准品混匀，离心。准备5~6个干净的1.5ml带盖离心管，分别加入90ul TE Buffer，标记稀释梯度和对应的量值，使用合适量程的移液器从标准品原管中的液面吸取10ul的标准品，注意枪头不要插入液面超过3mm，将该标准品加入到下一个稀释梯度的离心管中，加入时也请注意枪头插入液面不超过3mm，弃枪头，盖上离心管，用手指敲弹或漩涡振荡器进行混匀，简易离心后，重复上述步骤稀释下一梯度标准品。