产品内容

2×GREAT Real-Time Probe PCR Buffer

ROX Reference Dye 50×

ddH₂O

特性

GREAT Real-Time Probe PCR Kit 是由改良的 DNA polymerase，高效定量的PCR Buffer，dNTPs等预混的Real-Time Probe PCR反应液组成，具有高效、快速、灵敏度高的特点，且更易于操作，适用于探针法(TaqMan® ，Molecular Beacon等)进行Real Time PCR的专用试剂。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时监测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于DNA或微量DNA的检测。

GREAT Real-Time Probe PCR Kit 适合于4℃放置，使用时无须冻融，也无须另外添加PCR反应的其他组分，只需要加入合适的引物、探针和模板，即可进行Real-Time PCR反应。对于一些需要使用Reference Dye（比如：ROX）的定量PCR仪，本产品配备了ROX Reference Dye 50×，用户可根据需要配制使用。

用途

GREAT Real-Time Probe PCR Kit 可用于各种实时荧光定量PCR仪。

本品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好。

探针法Real Time PCR的方法原理

应用建议

使用前请先将试剂混匀并离心，再配制反应体系。

50ul反应体系的建议配制方法

2×GREAT Real-Time Probe PCR Buffer        25 ul

正向引物(10uM)                                       1.5ul(300nM)

反向引物(10uM)                                       1.5ul(300nM)

探针(2.5uM)                                              5ul (250nM)

根据需要使用ROX Reference Dye (50×)    1ul

模板 (DNA或cDNA)                                  X ul

ddH2O补充至总反应体积50ul。

20ul反应体系的建议配制方法

2×GREAT Real-Time Probe PCR Buffer        10 ul

正向引物(10uM)                                       0.6ul(300nM)

反向引物(10uM)                                       0.6ul(300nM)

探针(2.5uM)                                              2ul (250nM)

根据需要使用ROX Reference Dye (50×)    0.4ul

模板 (DNA或cDNA)                                  X ul

ddH2O补充至总反应体积20ul。

反应条件

94℃                                       1min

94℃                                       5sec.

60℃(56-64℃)                        30~60sec.

建议40循环。

保存

GREAT Real-Time Probe PCR Kit 适合于4℃放置，如频繁使用请于4℃即可，长期保存在-20℃。

运输

2-8℃

操作注意

1. 当同时需要进行多个Real-Time PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (2×GREAT Real-Time Probe PCR Buffer，引物，ROX等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。

2. 使用2×GREAT Real-Time Probe PCR Buffer时，应轻轻混匀，避免起泡；2×GREAT Real-Time Probe PCR Buffer 融解后如有不溶物请充分混合。配制反应液时应避免强光照射。

3. 反应液的配制、分装请一定使用新的 (无污染的) 枪头、Microtube等，尽量避免污染。

4. 如需要配制标准品进行标准曲线方法对样品进行定量时，建议配制方法如下：

DNA核酸标准品提取后，测定OD值定量，将ug/ul换算为copies/ul。

简易换算公式：copies = Xug DNA/ DNA size × 1.8 × 10¹⁵

计算每个PCR反应管内标准品的上样体积和相应的copies。稀释前，将标准品混匀，离心。准备5~6个干净的1.5ml带盖离心管，分别加入90ul TE Buffer，标记稀释梯度和对应的量值，使用合适量程的移液器从标准品原管中的液面吸取10ul的标准品，注意枪头不要插入液面超过3mm，将该标准品加入到下一个稀释梯度的离心管中，加入时也请注意枪头插入液面不超过3mm，弃枪头，盖上离心管，用手指敲弹或漩涡振荡器进行混匀，简易离心后，重复上述步骤稀释下一梯度标准品。

理想的标准品应具备：基线平整；指数区较明显，陡度大；平台区汇于一起；线性范围宽。上述稀释方法同样使用于其他倍数的稀释。

问题研讨

在建议的反应条件下如未能获得良好的扩增曲线，反应性能较差时，可以在100~1000nM的范围内分别调整引物浓度；可以在56℃~64℃调整退火/延伸温度和时间；根据不同的仪器、探针种类、荧光标记物等调整探针浓度，实际操作请参考相关仪器说明书。更多研讨请联系本公司技术支持[email protected]。

引物探针设计说明

进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物和探针非常重要。一般来说，Real Time PCR的引物和TaqMan探针需要符合以下规则。

引物规则：

qPCR目标片段大小：80-150bp(尽量限制在300bp以内)。

引物长度：17-25bp。

CG含量：40-60%(最好45-55%) 。

引物Tm值：两引物Tm值尽量接近，可用专用软件计算Tm值。

序列特点：整体上碱基均匀，避免GC rich或AT rich(特别是3’端)，尽量避免T/C连续，A/G连续。

3’末端注意：3’末端避免GC rich或AT rich；3’末端碱基最好为G 或C； 3’末端碱基尽量避免为T

互补性：引物内部或两条引物之间尽量避免3bp以上的互补序列，引物3’末端避免2bp以上的互补序列。

特异性：1）使用BLAST检索，确认引物特异性；2）使用SYBR染料法，通过溶解曲线评价引物特异性。

探针规则：

探针长度：20-24bp。

Tm值：探针的Tm比引物高8-10℃

位置：两引物之间，目的序列GC含量相对较高的区域设计，尽量靠近其中一条引物；尽量避免GC rich或AT rich (特别是3’端)避免T/C连续，A/C连续)；探针5’末端的第一个碱基不能是G。

互补性：Probe内部或Probe与两条引物之间避免3base以上的互补序列。

特异性：BLAST检索确认Probe特异性。