产品内容

cDNA合成试剂

Reverse Transcriptase                      200U/ul

2× Reverse Transcription buffer                                   

PCR试剂

HiFiFast DNA polymerase                 2.5U/ul

2×HiFi Fast PCR Mix

特性

First cDNA由Reverse Transcriptase合成，通过分子操作手段增加了该酶的热稳定性及逆转录效率，能高效迅速地将5kb以下的RNA模板转化成cDNA。PCR过程由HiFiFast DNA polymerase完成。由于HiFiFast DNA polymerase具备高保真性、高合成速度及高耐热性，本试剂盒可以快速、高效获得保真性高的特异PCR产物。

用途

快速、高效、高保真RT-PCR的首选。

应用指导

使用前请先将试剂混匀并离心，再配制反应体系。酶制品含有50%甘油，使用时需慢慢吸取。

使用方法

First cDNA合成：

反应体系

2× Reverse Transcription buffer               10ul

模板                                                10pg-500ng （viral or total RNA）

引物                                                20-50pmoles

Reverse transcriptase                            200U

ddH2O补充至总反应体积20ul

反应条件

42℃或50℃ 15-60min； 94℃，2min；4℃ ∞。

PCR扩增

2×HiFiFast PCR buffer                        25ul

RT产物                                          ＜5ul

正向引物(10uM)                             1~2.5ul

反向引物(10uM)                             1~2.5ul

HiFiFast DNA polymerase                   2.5U

ddH2O补充至总反应体积50ul。

反应条件：

产物大于1kb时：

94℃                                         2min

94℃                                         20sec.

55-65℃                                    30sec.

72℃                                        1kb/30sec

35~40循环

产物小于1kb

94℃                                        20sec.

68℃                                       1kb/30sec.

35~40循环

注意

随机引物及Oligo dT引物并不是逆转录成功的保证，因此本试剂盒不包括随机引物及Oligo dT引物。

由于复杂结构的RNA可能对逆转录过程产生影响，对于复杂结构的RNA模板，建议将RNA样本先进行热变性处理（65℃，5min处理后立即冰浴），然后再进行逆转录反应。

配制PCR反应体系时，逆转录产物的加样量不要超过PCR反应体系的1/10，以免逆转录反应体系中的各种成分对PCR反应产生抑制作用。

克隆策略

HiFiFast DNA polymerase产物属平滑末端，无3’端突出，不可直接用于TA克隆，建议按下述策略实施克隆：

1.          可运用InFusion方法将PCR产物链接到终载体上。

2.          运用引物将克隆酶切位点导入PCR产物后实施酶切后克隆。

3.          运用平端载体实施克隆，使用的引物5’端磷酸化碱基可直接克隆于平滑末端的载体；如果使用的引物5’端没有特别进行磷酸修饰，可将PCR产物磷酸化处理后直接克隆于平滑末端的载体。

4.          将PCR产物进行加A反应，直接应用TA克隆。在PCR反应结束后，每个反应体系中加入5U Taq酶（Cat. Z011-1000），70-75℃培育15-30分钟即可。

保存

-20℃

运输

2-8℃