产品内容

HiFiFast PCR Mix 2x

HiFiFast DNA polymerase     2.5U/ul

特性

HiFiFast PCR Mix 是由HiFiFast DNA polymerase和HiFiFast PCR Mix，组成，具有HiFiFast DNA polymerase的特点，且更易于操作。

快速

HiFiFast PCR Mix的延伸速度是Taq的2倍，达1kb/30s。当使用cDNA作为模板时，建议稍微延长扩增时间至1kb/40s。

便捷

HiFiFast PCR Mix经过对PCR反应中各组份进优化，在进行PCR扩增时无须另外添加Mg²⁺、dNTP等成分，只需要加入2.5U (50ul反应体系) HiFiFast DNA polymerase和合适的引物和模板，即可进行PCR反应。

用途

HiFiFast PCR Mix可用于高保真要求的快速克隆，适用于基因组9kb及以下片段。

使用方法

使用前请先将试剂混匀并离心，再配制反应体系。酶制品含有50%甘油，使用时需慢慢吸取。

50ul反应体系的配制：

HiFiFast PCR Mix                                      25ul

模板                                                       1-100ng（质粒）

                                                               10-1000ng（基因组）

正向引物(10uM)                                       1~2.5ul

反向引物(10uM)                                       1~2.5ul

ddH2O补充至总反应体积                       49ul

HiFiFast DNA polymerase (2.5U/ul)               1ul

反应条件：

1kb-9kb target

95℃                                              1min

95℃                                               20sec.

55~72℃                                                       30sec.

72℃                                               1kb/30sec

建议35~40循环

72℃                                                             7min

4℃                                            ∞

在扩增较小片段 (<1kb) 时，需要适当缩短退火和延伸时间，以得到较好的实验结果。

PCR结束后，扩增产物短期可放4℃保存，长期保存建议在-20℃条件下。

注意

HiFiFast DNA polymerase延伸速度为2kb/min，延伸时间过长会降低产量， 可缩短延伸反应时间来解决这一问题。模板GC含量过高时，可使用98℃进行变性反应来实施扩增。

HiFiFast DNA polymerase具有较高3’~5’外切酶活性，可降解与模板结合的引物导致部分或完全降解，从而电泳检测时无扩增产物或弥漫型条带。因此，建议所有操作在冰上进行，配制反应体系时应先加入模板和引物，补足水后再加酶，并立即进行PCR反应，以有利于获得更好的实验结果。

克隆策略

HiFiFast DNA Mix产物属平滑末端，无3’端突出，不可直接用于TA克隆，建议按下述策略实施克隆：

1）   可运用InFusion方法将PCR产物链接到终载体上。

2）   运用引物将克隆酶切位点导入PCR产物后实施酶切后克隆。

3）   运用平端载体实施克隆，使用的引物5’端磷酸化碱基可直接克隆于平滑末端的载体；如果使用的引物5’端没有特别进行磷酸修饰，可将PCR产物磷酸化处理后直接克隆于平滑末端的载体。

4）   将PCR产物进行加A反应，直接应用TA克隆。在PCR反应结束后，每个反应体系中加入5U Taq酶（Cat. Z011-1000），70-75℃培育15-30分钟即可。

保存

-20℃恒温保存1年

运输

2-8℃